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　凱氏定氮儀是根據(jù)蛋白質(zhì)中氮的含量恒定的原理，通過測定樣品中氮的含量從而計(jì)算蛋白質(zhì)含量的儀器。因其蛋白質(zhì)含量測量計(jì)算的方法叫做凱氏定氮法，故被稱為凱氏定氮儀，又名定氮儀、蛋白質(zhì)測定儀、粗蛋白測定儀。

　　原理

　　將有機(jī)化合物與硫酸共熱使其中的氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。在這步中，經(jīng)常會(huì)向混合物中加入硫酸鉀來提中間產(chǎn)物的沸點(diǎn)。樣本的分析過程的終點(diǎn)很好判斷，因?yàn)檫@時(shí)混合物會(huì)變得無色且透明（開始時(shí)很暗）

　　在得到的溶液中加入少量氫氧化鈉，然后蒸餾。這步會(huì)將銨鹽轉(zhuǎn)化成氨。而總氨量（由樣本的含氮量直接決定）會(huì)由反滴定法確定：冷凝管的末端會(huì)浸在硼酸溶液中。氨會(huì)和酸反應(yīng)，而過量的酸則會(huì)在甲基橙的示下用碳酸鈉滴定。滴定所得的結(jié)果乘以定的轉(zhuǎn)換因子就可以得到結(jié)果。

　　使用步驟

　　消化

　　1、準(zhǔn)備6個(gè)凱氏燒瓶，標(biāo)號(hào)。1、2、3號(hào)燒瓶中分別加入適當(dāng)濃度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號(hào)燒瓶作為對(duì)照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對(duì)樣品測定行校正。4、5、6號(hào)燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其余所加試劑與1、2、3號(hào)燒瓶相同。2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置。用微火加熱煮沸，此時(shí)燒瓶內(nèi)物質(zhì)炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫，務(wù)注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力，保持瓶內(nèi)液體微沸，至溶液澄清后，再繼續(xù)加熱使消化液微沸15min。在消化過程中要隨時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶，以使內(nèi)壁粘著物質(zhì)均能入底，以保證樣品消化。消化時(shí)放出的氣體內(nèi)含SO2，具有強(qiáng)烈刺激性，因此自始自終應(yīng)打開抽水泵將氣體抽入自來水排出。整個(gè)消化過程均應(yīng)在通風(fēng)櫥中行。消化后，關(guān)閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。

　　蒸餾吸收

　　蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都由蒸氣發(fā)生、氨的蒸餾和氨的吸收三分組成。

　　1、儀器的洗滌

　　儀器安裝前，各件需經(jīng)般方法洗滌干凈，所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水煮10min，再水洗數(shù)次，然后安裝并固定在只鐵架臺(tái)上。儀器使用前，微量管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌，以除去管道內(nèi)可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可。較長時(shí)間未使用的儀器，重復(fù)蒸氣洗滌，不得少于三次，并檢查儀器是否正常。仔細(xì)檢查各個(gè)連接處，保證不漏氣。在蒸氣發(fā)生器中加約2/3體積蒸餾水，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結(jié)果，并放入少許沸石（或毛細(xì)管等），以防沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經(jīng)插管入反應(yīng)室，但玻杯內(nèi)的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發(fā)生后，立即關(guān)閉廢液排放管上的開關(guān)，使蒸氣只能入反應(yīng)室，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過定氮入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置個(gè)錐形瓶接收冷凝水。從定氮發(fā)燙開始計(jì)時(shí)，連續(xù)蒸煮5min，然后移開煤氣燈。沖洗畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動(dòng)抽到反應(yīng)室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下?lián)Q放個(gè)盛有硼酸-示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口浸沒在溶液中，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內(nèi)已洗干凈。移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。

　　2、無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品的蒸餾吸收

　　由于定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和滴定的操作，初學(xué)者宜用無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品行反復(fù)練習(xí)，再行有機(jī)氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測試三次。取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基藍(lán)-甲基紅混合示劑（呈紫紅色）3～4滴，蓋好瓶口待用。取其中只錐形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸沒在溶液中。注意：在此操作之前打開收集器活塞，以免錐形瓶內(nèi)液體倒吸。準(zhǔn)確吸取2mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液加到玻杯中，小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次，并放人蒸餾瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶液，使堿液慢慢入蒸餾瓶中，在堿液尚未入時(shí)，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使半水入蒸餾瓶，半留在小玻杯中作水封。關(guān)閉收集器活塞，加熱蒸氣發(fā)生器，行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時(shí)起，再蒸餾3～5min，移動(dòng)錐形瓶使瓶內(nèi)液面離開冷凝管下口約lcm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口，再繼續(xù)蒸餾1min，移開錐形瓶，蓋好，準(zhǔn)備滴定。在次蒸餾畢后，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器間的橡膠管，排除反應(yīng)畢的廢液，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除。如此反復(fù)沖洗干凈后，即可行下個(gè)樣品的蒸餾。按以上方法用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨再做兩次。另取2mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨行測定二次。將各次蒸餾的錐形瓶起滴定。

　　3、未知樣品及的蒸餾吸收

　　將消化好的蛋白樣品三支，對(duì)照液三支，依次作蒸餾吸收。加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或?qū)φ找褐校ㄟ^小玻杯加到反應(yīng)室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液并倒入反應(yīng)室內(nèi)。其余操作按標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的蒸餾行。由于消化液內(nèi)硫酸鉀濃度而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶內(nèi)倒出，加入熱蒸餾水5 mL稀釋之，如果有結(jié)晶析出，微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其入反應(yīng)室。此外，還應(yīng)當(dāng)注意趁儀器洗滌尚未冷卻時(shí)立即加入樣品或?qū)φ找海駝t消化液通過冷卻的管道容易析出結(jié)晶，成堵塞。